产品货号：
JN0014
中文名称：
耐高温M-MuLV反转录酶(RNase H-)
英文名称：
BalbScript II Reverse Transcriptase(RNase H-)
产品规格：
10kU|50kU
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是对M-MuLV(RNase H-)进行基因工程改造，表达并纯化的高温逆转录酶，比M-MuLV(RNase H-)提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下(50～60℃)进行cDNA第一链的合成，高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃，具有热稳定相强，灵敏度高，特异性高，聚合能力强等优点。
- 1st Strand cDNA的合成；
- cDNA Probe的制备；
- RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。
以Poly(rA)·Oligo(dT)为模板/引物，在50℃、10分钟条件下，掺入1nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。
| 组分 | 10kU | 50kU |
| 耐高温M-MuLV反转录酶(RNase H-,200U/μL) | 50μL | 50μL×5 |
| 5×BalbScript II RT Buffer | 1mL | 1mL×5 |
保存：-20℃
经多次柱纯化，SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一目的条带。PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染，无RNA酶污染。
- 产品反应Buffer中含有高浓度的DTT，低温下或者冻融可能会导致沉淀析出，请恢复至室温并混匀后使用。
- 用DEPC处理实验用到的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
- 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
- 试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子确保扣严。
- 纯化过的RNA必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
- 为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的RNA模板。
- 最快可达2kb/min，需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当延长反转录时间。
- 第一链cDNA合成
试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。- 按顺序加入以下反应物：
成分 用量 模板RNA 总RNA 0.1ng～5μg poly(A) mRNA 10pg 特异性RNA 0.01pg 引物 Oligo (dT)18 1μL Random N6 1μL 基因特异性引物 15～20pmol 5×BalbScript RT Buffer 4μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL dNTPs(10mM) 2μL 耐高温M-MuLV反转录酶(200U/μL) 1μL RNase-Free Water 至20μL - 可选优化步骤：如果RNA模板GC含量高或含有二级结构，可先将模板与引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5min，冰上冷却。
- 轻轻混匀，离心。
- 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，50℃孵育15～30min。
使用随机六聚体引物时，25℃.先孵育5min，随后50℃孵育15～30min。
对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板，使用60℃孵育15～30min。 - 70℃加热5min终止反应。
- 反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，-20℃保存少于一周的时间。长时间保存建议-70℃放置。
- 按顺序加入以下反应物：
- 第一链cDNA的PCR扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。- 常用反应体系（50μL）：
注：Mg2+终浓度为2mM。成分 用量 2×Taq Master Mix 25μL 上游引物 0.2～1.0μM（终浓度） 下游引物 0.2～1.0μM（终浓度） 模板 质粒 1～50ng 基因组 10ng～1μg ddH2O 至50μL - 常用PCR循环：
温度 时间 循环数 94℃ 90s 1 94℃ 20s 30 57℃ 20s 72℃ 1kb/60s 72℃ 5min 1 4℃ 保温 1
- 常用反应体系（50μL）：
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